reproductology

Preimplantačná diagnostika (PGD) diagnostika dedičných ochorení a embryí

Genetické testovanie je metóda používaná na diagnostiku dedičných defektov embryí získaných in vitro fertilizáciou pred tehotenstvom. Predimplantačná diagnóza (PGD) je alternatívou k amniocentéze a biopsii chorionického vilu, ktorá často nasleduje ťažké rozhodnutie ukončiť tehotenstvo, ak sú výsledky nepriaznivé.. Dnes je PGD jedinou možnou možnosťou vyhnúť sa vysokému riziku vzniku dieťaťa s genetickými chorobami..

 V akých prípadoch sa PGD vykonáva v prípade genetických patológií

  • Indikácie pre predimplantačnú diagnostiku podľa genetiky:
  • Nosič autozomálnych recesívnych ochorení;
  • Patológia spojená s chromozómom X;
  • Páry s významnými translokáciami chromozómov, ktoré interferujú s implantáciou, vyvolávajú spontánne potraty alebo vyvolávajú duševné alebo fyzické problémy u potomstva;
  • Nosič autozomálnych dominantných chorôb.

Predimplantačná diagnostika sa používa na patologické príznaky súvisiace s pohlavím, defekty jedného génu a chromozómové poruchy..

Sexuálne zneužívanie

X-spojené choroby sa prenášajú na dieťa cez matku, ktorá je nosičom. Patologický X chromozóm spôsobuje ochorenie u synov, ktorí nezdieľajú normálny X chromozóm od svojho otca, ale dostanú sa na Y chromozóm. V budúcnosti sa očakáva narodenie zdravých chlapcov, ale pravdepodobnosť prepravy dcér je 50% za predpokladu, že zdravie matky.

Je dôležité

Choroby spojené s chromozómom X sa nikdy neprenášajú z otca na syna.

Autozomálna recesívna patológia zahŕňa hemofíliu, väčšinu neuromuskulárnych dystrofií a stovky ďalších ochorení..

Autozomálne dominantné poruchy sa prejavia ako Rettov syndróm, pseudo-hyperparatyroidizmus, rachity rezistentné na vitamín D, Bloch-Sulzbergerov syndróm (dedičná porucha pigmentácie kože s patológiou vizuálneho aparátu, zuby a centrálny nervový systém) atď..

Y chromozóm nesie zanedbateľný počet génov, ale niektoré patológie sexuálnej diferenciácie sú spojené s ním..

V závažných formách zhoršenej spermatogenézy (kriticky malé množstvo alebo úplná absencia zárodočných buniek muža) v 18% prípadov sú mikrodelecie diagnostikované v géne faktora azoospermie umiestnenom na dlhom ramene chromozómu U.

Jediné génové chyby

PGD ​​sa používa na identifikáciu jednotlivých génových defektov, ktoré spôsobujú množstvo ochorení:

  • Cystická fibróza;
  • Thajská Sachsova choroba;
  • Kosáčikovitá anémia;
  • Huntingtonova choroba.

S týmito patológiami genetická diagnostika detekuje defekt použitím molekulárnych metód pomocou amplifikácie (multiple replikácie) DNA z jednej bunky pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR).

Chromozomálne poruchy

Translokácia, inverzia a delécia vedú k poškodeniu chromozómu, ktorý sa dá detegovať pomocou fluorescenčnej hybridizácie. Pre niektoré páry je pravdepodobnosť životaschopného tehotenstva bez PGD zanedbateľná, pretože predchádzajúce pokusy viedli k vzniku embryí s chromozomálnou mutáciou a skončili spontánnymi potratmi.

Predimplantačný genetický skríning: relatívne indikácie

Podľa štúdií je väčšina tehotenstiev potratov spôsobená aneuploidizáciou, čo je narušenie počtu chromozómov. Keďže zdravé embryá sa prenášajú do maternice, pravdepodobnosť potratu v prvom a druhom trimestri klesá.

V súčasnosti neexistuje konkrétny zoznam indikácií pre PGD.

Predimplantačné genetické vyšetrenie sa považuje za žiadúce v nasledujúcich prípadoch:

  • Plánované tehotenstvo u staršej ženy.
  • Zaťažená pôrodnícka a gynekologická história s opakovanými potratmi.
  • Neúspešné opakované pokusy o IVF, vrátane metódy ICSI.
  • Ťažký faktor neplodnosti mužov.

Skutočnosť, že riziko vzniku aneuploidie sa s vekom zvyšuje. Chromozómy sú menej pravdepodobné, že sa správne rozdelia, čo vedie k ďalšiemu alebo chýbajúcemu chromozómu v embryu. Patologický počet chromozómov je pre matky vo veku 35 až 39 rokov vyšší ako 20% a vo veku 40 rokov a starších dosahuje 40%.

Frekvencia aneuploidie u detí narodených matkám vo veku 35-39 rokov - 0,6-1,4%, starších ako 39 rokov - 1,6 - 10%.

Je dôležité

Nie všetky tehotenstvá končí pri narodení životaschopného dieťaťa, niekedy sa prerušuje samo prerušenie skôr, ako žena môže byť podozrivá z jej stavu..

Príkladom častej aneuploidie je trizómia 21 chromozómu, ktorá vedie k Downovmu syndrómu. Frekvencia trisómie 21 v životaschopnom plodu bola stanovená v závislosti od veku matky. Podľa výsledkov je optimálna veková hranica pre deti od 20 do 24 rokov (najnižšie riziko je 1/1400). Vo veku 40 - 1/100, starších ako 45 rokov - 1/25.

Opakované potraty a diagnostika PGD

Ak má žena 2 alebo viac po sebe idúcich prerušení tehotenstva až do 20 týždňov, je PGD oprávnená pred IVF. Príčina je často neznáma, ale chromozomálne abnormality v prerušených embryách sú diagnostikované v 50-80%.

Venujte pozornosť

Štúdie ukázali, že páry s viacerými potratmi podliehajú vyššiemu percentu aneuploidných embryí..

Neúspech IVF niekoľkokrát za sebou

Tri alebo viac neúspešných pokusov IVF zahŕňajúcich vysokokvalitné embryá môže naznačovať chromozomálne abnormality. Okrem toho je potrebné spomenúť na imunologické a maternicové faktory, ktoré prispievajú k zhoršeniu implantácie..

Faktor mužskej neplodnosti

Mužský hypogonadizmus vedie k vzniku embryí s chromozomálnymi abnormalitami. V normálnej sperme sa vyskytuje asi 3-8% chorých spermií. Ich počet sa výrazne zvyšuje u mužov s ťažkou neplodnosťou (zníženie množstva, zlá morfológia a zhoršená motorická aktivita) na 27-74%.

Pri použití intracytoplazmatickej injekcie spermií do buniek vajíčok nie je zlá kvalita spermií prekážkou pre koncepciu biologicky domorodého dieťaťa. Zistilo sa, že rôzne genetické poruchy sú spojené s mužským faktorom neplodnosti. Častejšie tieto zahŕňajú aneuploidiu, Klinefelterov syndróm, Y chromozómovú mikrodeleciu, poškodenie androgénneho receptora a iné autozomálne génové mutácie (cystická fibróza).

Je dôležité

Počas postupu ICSI sa vypne prirodzený výber, čím sa zvýši riziko prenosu genetických mutácií na potomstvo.

Výber pohlavia

PGD ​​môže určiť pohlavie embrya, ale túžba porodiť chlapca alebo dievča bez dôkazu (genetické ochorenia spojené s pohlavím) nie je etické.

Súlad s ľudským leukocytovým antigénom (HLA)

Medzi novými indikáciami PGD patrí aj HLA porovnanie. Táto metóda sa môže použiť na vylúčenie genetickej patológie. V situáciách, keď rodina už má dieťa s recesívnou chorobou a je potrebná liečba transplantáciou kmeňových buniek alebo kostnej drene (talasémia, leukémia), Je možné vybrať "vhodné" embryo, ktoré sa po narodení stane darcom pre proband (brat alebo sestra). Prvý prípad je opísaný príkladom rodiny s dieťaťom trpiacim Fanconiho anémiou a PGD bola vykonaná na výber zdravého embrya s rovnakým typom HLA ako chorého brat. Použitie PGD v takýchto situáciách je diskutabilné z morálnych a etických dôvodov..

Predimplantačná diagnóza: ako sa to robí a aké sú spôsoby

Páry v rizikovej zóne sú konzultované genetikom, ktorý hodnotí riziko prenosu genetickej patológie. Vykonajte testy, ktoré potvrdia diagnózu jedného z rodičov. V závislosti od genetického ochorenia je vybraná diagnostická metóda, pomocou ktorej je možné identifikovať zmeny embrya..

Na získanie biomateriálu pre PGD sa používa len IVF.. Tretí alebo piaty deň po oplodnení sa extrahuje požadovaný biomateriál. Genetická analýza pred transplantáciou sa uskutočňuje použitím polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), fluorescenčnej hybridizácie (FISH), komparatívnej genómovej hybridizácie (CGH) a testovania NGS.

Zdravé embryá sa prenášajú do maternice (spravidla nie viac ako 2), zatiaľ čo zvyšok je vitrifikovaný. Rýchle zmrazovanie vám umožňuje používať ich v nasledujúcich cykloch IVF.

PCR

PCR sa používa na diagnostiku defektov jedného génu vrátane dominantných a recesívnych porúch.. PCR (niekedy nazývaná amplifikácia DNA) je metóda, pri ktorej je určitá sekvencia kopírovaná mnohokrát, čo umožňuje analýzu.

Pre presnú diagnózu potrebujete vysokokvalitnú vzorku DNA, ktorú je ťažké získať z jednej bunky..

Chyby v analýze PCR môžu viesť k prenosu nekvalitného embrya v 11% autozomálnej dominantnej patológie a 2% v recesívnom.

Polymerázová reťazová reakcia umožňuje určiť diagnózu, ak nejakú existuje:

  • Defekty jedného génu pri autozomálnej chorobe;
  • Jednotná génová patológia u mužskej neplodnosti;
  • Identifikácia rodov pre choroby súvisiace s X..

Fluorescenčná hybridizácia (FISH)

FISH sa používa na určenie pohlavia pre choroby viazané na X, chromozomálne abnormality a aneuploidiu.

Sondy, ktoré predstavujú malé DNA fragmenty zodpovedajúce analyzovaným chromozómom sa viažu na "ich" chromozóm. Každá sonda má vlastné farbivo. Proces sa vizualizuje pod fluorescenčným mikroskopom. Počet chromozómov každej farby sa počíta a vyvodia sa závery..

Fluorescenčná in situ hybridizácia je v prípade potreby oprávnená na vykonanie:

  • Aneuploidný screening u žien starších ako 38-39 rokov;
  • Počítanie počtu chromozómov u mužskej neplodnosti;
  • Identifikácia pohlavia pri chorobách súvisiacich s X;
  • Diagnóza rodičovských translokácií, ktoré viedli k opakovaným viacerým potratom.

Porovnávacia genómová hybridizácia (CGH, SHG)

Ľudská bunka obsahuje 23 párov chromozómov; analýza FISH však umožňuje presné vyhodnotenie iba 7 až 9 chromozómov v každej získanej bunke. Následkom toho mnohé abnormálne embryá zostávajú nezistené a môžu sa použiť pri transfere.

Pri vykonávaní porovnávacej genómovej hybridizácie sa testovaná DNA ošetrí fluorescenčným farbivom (zeleným) a pre vzorku sa použije červená farba. Potom sa dve bunky hybridizujú a porovnáva sa pomer medzi týmito dvoma farbami. Ak chromozómová analýza ukazuje nadbytok červenej farby, embryonálne jadro obsahuje ďalší chromozóm. Ak je nadbytok zelenej farby, potom jeden z chromozómov chýba v jadre embrya.. SHS umožňuje nielen vyhodnotenie všetkých 23 chromozómov, ale aj detailnejšie zobrazenie dĺžky, ktorá dokáže odhaliť nerovnováhu chromozómových segmentov.

Táto metóda momentálne trvá 72 hodín. Vzhľadom na obmedzenú životnosť embryí v kultivačnom médiu je potrebné vitrifikácia embryí. Aj pri vysokom prežívaní môže kryokonzervácia viesť k 30% strate životaschopných embryí.. 

Venujte pozornosť

Vo veľkých reprodukčných klinikách už pracujú na zrýchlených protokoloch SHG, kde sa výsledok stáva známy po 24 hodinách, čo neumožňuje vynechať optimálny čas pre prenos.

NGS testovanie

Metóda zahŕňa stanovenie sekvencie nukleotidov (základných štruktúr dedičného materiálu) v RNA a DNA.

Medzi výhody patrí:

  • schopnosť posúdiť užitočnosť / chyby všetkých chromozómov;
  • minimalizácia chýb v dôsledku automatizácie procesov;
  • simultánne dekódovanie viacerých sekvencií;
  • opakovaná analýza lokusu genetického kódu;
  • vysoká citlivosť a presnosť;
  • minimalizácia chybného záveru (0,001%);
  • atraumatické pre embryo;
  • zvýšiť šance na úspešnú IVF.

Absolútne indikácie pre NGS: prenos chromozomálnej abnormality rodičov alebo rodu, genetické choroby spojené s pohlavím.

Predimplantačná štúdia NGS zahŕňa nasledujúce kroky:

  • biopsia embrya vo fáze blastocysty, častejšie biopsia trophoectodermu;
  • izolácia molekúl nukleovej kyseliny;
  • čím sa vytvorí základ pre ďalšie genetické testovanie,
  • amplifikácia na získanie amplikónov pomocou metódy PCR, ktoré sa berú ako vzorka;
  • počítačová vizualizácia modelu primárnej DNA / RNA v dôsledku viacerých analýz neparalelných fragmentov.

Špecialista hodnotí počítačovú grafiku, ktorá ukazuje patológiu vo forme poklesov alebo vrcholov.

Na základe testovania NGS sa embryá s nízkou vitalitou alebo klinicky výraznými mutáciami odmietajú a zvyšok po rozmrazení sa používa v protokoloch IVF.

Nie všetky reprodukčné kliniky vykonávajú túto analýzu..

Je dôležité

Predimplantačná diagnóza nie je zahrnutá do zoznamu služieb pre povinné zdravotné poistenie a je platená pacientom.

Čo sa skúma s PGD

Väčšina kliník vykoná biopsiu embryí v štádiu štiepenia, ale pre PGD sa môže použiť jedna z troch metód.

Biopsia polárneho tela

Metóda je vhodná na detekciu genetickej patológie u ženy, pretože sa odhaduje počet chromozómov vo vaječnej bunke. Biopsia polárneho tela neumožňuje získať informácie o chromozomálnej štruktúre budúceho embrya, pretože dostane druhú polovicu genetického materiálu od otca. Táto metóda sa zriedka používa..

Biopsia embrya s vyklenutím

Najbežnejšou metódou PGD je štúdium jediného blastoméru získaného z vývojového embrya 3. dňa. Užívanie blastoméru je technicky náročný postup, ktorý sa vykonáva pomocou špeciálneho mikroskopu a mikromanipulátorov. Cieľ - odstránenie požadovaných buniek s minimálnou traumou embrya.

V 3. deň vývoja sa embryo skladá z 6 až 10 buniek, pred manipuláciou sa udržuje v špeciálnom prostredí počas 20 minút, aby sa znížilo lepenie blastomérov. Potom je embryo fixované a vo vnútri oblasti pellucida sa vytvorí otvor, ktorý otvára prístup k blastomerem. Tento postup sa nazýva "šrafovanie" a môže sa vykonávať pomocou roztoku kyseliny, laserom alebo mechanicky. Do otvoru sa vloží pipeta, ktorá sa zameriava na vybraný blastomér s viditeľným jadrom. Vdýchnutím sa blastomér extrahuje a spracuje na FISH alebo na PCR (diagnóza PCR), v závislosti od genetickej patológie. Embryo sa ponorí do vhodného kultivačného média..  

Nevýhody metódy zahŕňajú skutočnosť, že embryo môže byť mozaika a pre genetickú analýzu existuje pravdepodobnosť odstránenia "zdravého" blastoméru.

Blastocystová biopsia

Tvorba blastocysty začína 5. deň a je určená nahromadením vnútornej a vonkajšej bunkovej hmoty. V tomto štádiu embryo pozostáva z približne 100 buniek. Prostredníctvom dierky sa bunky odoberajú z trophoectodermu pomocou pipety s tenkou biopsiou. Vnútorná bunková hmotnosť nie je zranená. Genetická analýza sa uskutočňuje s použitím FISH alebo PCR.

Obmedzenie diagnostického postupu - embryo mozaika a požadovaný čas na štúdium - 24-48 hodín, čo výrazne znižuje životaschopnosť a narúša implantáciu.

Jediným východiskom je zmrazenie biomateriálu, po ktorom mierne trpí kvalita embryí.

PGD ​​sa vo väčšine prípadov dokončí do 24 hodín po vykonaní biopsie, čo vám umožní uskutočniť prevod v deň 4 alebo 5.

Venujte pozornosť

Väčšina kliník analyzuje 24 chromozómov (22 autozómov a 2 pohlavné chromozómy) s použitím porovnávacej genómovej hybridizácie na embryo vo veku 5 dní..

Výhody a nevýhody genetickej analýzy v 3-dňových a 5-dňových embryách

Tri dni:

  • väčšie riziko zranenia (približne 15%, dôležitá úloha, ktorú zohráva kvalifikácia embryológov);
  • schopnosť vykonávať analýzu len na 9 chromozómov, vrátane iba najbežnejších dedičných chorôb;
  • pravdepodobnosť biochemického a zmeškaného potratu v dôsledku patológie v nepreskúmaných chromozómoch;
  • mozaicismus.

Päť dní:

  • životaschopnosť embryí klesá, pretože existujú mimo tela matky, je potrebné čakať na biopsiu, aby sa uskutočnila (je možné postihnúť alebo preniesť skorý blastocyst)
  • zastavenie vývoja "dobrých" embryí nesúvisiacich s genetickými faktormi;
  • možnosť vykonania komplexnej chromozomálnej analýzy;
  • nízke riziko poškodenia embrya (približne 5%).
Je dôležité

Embryá s nízkou kvalitou sa odmietnu, ak sa uskutočnil ich prenos, tehotenstvo buď nedošlo, alebo skončilo vo vývoji alebo samo prerušení v počiatočnom štádiu.

Aká je najlepšia cesta k PGD

Odborníci sa domnievajú, že porovnávacia genómová hybridizácia je lepšia ako

FISH diagnostika, keďže možnosti tejto metódy sú širšie a riziko poškodenia embrya je menšie. So zvláštnosťami karyotypu rodiča (napríklad translokácia) existuje možnosť interchromozomálneho efektu spájajúceho - riziko nesprávnej divergencie akýchkoľvek chromozómov a nielen tých, ktoré sú poškodené a diagnostikované počas karyotypu v matke alebo v otcovi.

Nevýhody zahŕňajú potrebu kryokonzervácie a vysoké náklady.

Štúdia FISH je vhodnejšia ako PCR, pretože polymerázová reakcia nesie riziko nesprávnej diagnostiky v dôsledku biologickej kontaminácie..

Dnes najefektívnejšia metóda - NGS - sekvenovanie novej generácie.

Mišina Victoria, urolog, lekár