Účelom uskutočnenia metód molekulárneho genetického výskumu je určiť prítomnosť modifikácií a zmien niektorých chromozómov, oblastí DNA alebo génov. Táto metóda práce s DNA bola široko používaná v praxi v 70. - 80. rokoch minulého storočia. minulého storočia.
Kedy robia molekulárne genetické štúdie
Molekulárne genetické štúdie pomáhajú diagnostikovať:
- Monogénne genetické choroby;
- Pravdepodobnosť vzniku onkologických ochorení;
- Prítomnosť faktorov vyvolávajúcich multifaktoriálne ochorenia.
Určuje riziko vzniku onkologických procesov pomocou molekulárneho genetického výskumu:
- Riziko vzniku rakoviny žalúdka a štítnej žľazy;
- Pravdepodobnosť rakoviny hrubého čreva a skoré štádiá tejto choroby;
- Genetická predispozícia k rozvoju rakoviny tela maternice, vaječníkov, prsnej žľazy a prostaty;
- Prítomnosť rekombinácie génov ABL / BCR detegovaných v leukémii;
- Prítomnosť predpokladov zabezpečujúcich účinnosť protinádorovej liečby gefatinibom v prítomnosti rakoviny iných ako malých buniek .
Pri vykonávaní molekulárnych genetických testov na prítomnosť geneticky podmienených predpokladov pre vývoj multifaktoriálnych ochorení je možné identifikovať riziko vývoja:
- hypertenzná chorobu;
- preeklampsie;
- reumatoidná artritída;
- osteoporóza;
- poruchy metabolizmu lipidov;
- diabetes mellitus typu 1 a 2;
- choroby reprodukčného systému.
Pomocou tejto metódy sa hodnotí metabolizmus a platnosť používania určitých liekov..
Kto je predpísaný molekulárno-genetický výskum
Molekulárne genetické testy sa ukazujú jednotlivcom:
- trpí neplodnosťou;
- vystavené nepriaznivým environmentálnym faktorom;
- majú blízkych rodinných príslušníkov trpiacich onkologickými, mentálnymi, vaskulárnymi a endokrinnými ochoreniami.
Ako je molekulárny genetický test
Prvá etapa molekulárnej genetickej analýzy je veľmi dôležitá a spočíva v získaní vzoriek RNA a DNA, ktoré sú jednotlivými fragmentmi bunkovej DNA alebo jej celého reťazca. Na izoláciu požadovaného počtu fragmentov sa používa amplifikačná metóda, t.j. ich reprodukcia polymerázovou reťazovou reakciou (enzymatická replikácia).
Analýza molekúl DNA vyžaduje ich predbežné rozdelenie na časti a liečbu bakteriálnymi endonukleázami (restriktázami) - enzýmami, ktoré môžu zredukovať dvojitú helix DNA na 4-6 párov..
DNA fragmenty sú oddelené v dĺžke a veľkosti pomocou špeciálneho gélu (polyakrylamid a agaróza) s použitím elektroforézy. Pod ich pôsobením sa pohybujú gélom s rôznymi rýchlosťami a za nimi zostávajú diskrétne pásy..
Molekulárne genetické štúdie dedičných chorôb sa tiež používajú na štúdium ľudského genómu. Southern hybridizačná hybridizácia umožňuje v tomto prípade určiť špecifické fragmenty DNA nevyhnutné na tento účel. Súčasne sa najprv uchýli k denaturácii DNA, v dôsledku čoho sa fragmenty získajú vo forme jedného reťazca a prenesú sa na filter (nylon alebo nitrocelulózu), ktorý sa namočí v tlmivom roztoku.
Gél, na ktorom sú umiestnené fragmenty DNA, sa prenesie na filtračný papier so soľným roztokom (s vysokou% koncentráciou). Filtruje sa nitrocelulózový filter a filtruje, ale suchý papier (na absorpciu fyziologického roztoku) sa umiestni na začiatok. Výsledkom je, že jednovláknová DNA zostáva na filtri v rovnakej polohe ako na géli..
Na identifikáciu potrebných fragmentov sa uskutočňuje postup hybridizácie DNA s jeho klonovaným fragmentom alebo rádioaktívnou DNA sondou. Výsledok tohto postupu je detekovaný rádioutografiou, v dôsledku čoho sa všetky komplementárne sondy sekvencie DNA odrážajú vo forme rádioaktívneho pásma..
Metóda Southern umožňuje obnoviť reštrikčnú mapu ľudského genómu v určitej časti génu. To umožňuje zistiť prítomnosť akýchkoľvek defektov v samotnom géne. Vyvinuté metódy sa považujú za dosť účinné a umožňujú čo najpresnejšie diagnostikovanie dedičných ochorení. Na tento účel sa DNA extrahuje z embryonálnych buniek, ktoré sa nachádzajú v plodovej vode. Následne sa hybridizuje pomocou Southern blot s rádioaktívnou DNA sondou. V dôsledku toho je veľmi ľahké rozpoznať abnormálny emb-ion, pretože jeho DNA hybridizuje výhradne so sondou DNA, ktorá je komplementárna k mutantnej sekvencii..
Moderná veda používa množstvo metód na identifikáciu mutácií. Všetky sú rozdelené na metódy nepriameho a priameho molekulárneho výskumu..
Nepriama metóda detekcie mutácií sa používa, ak je známa poloha génu na genetickej mape, ale jeho nukleotidová sekvencia nie je dešifrovaná..
Priama diagnóza môže mať niekoľko typov:
- sekvenovania. Toto je technika na identifikáciu nukleotidovej sekvencie na určenie nahradenia báz v konkrétnom fragmente..
- Blot hybridizácia, ale Southern. Ide o reštrikčnú analýzu, pomocou ktorej nájdu mutácie, ktoré majú porušenie stránky restimation..
- Alespecifická hybridizácia so syntetickou sondou. Táto metóda tiež umožňuje detegovať mutácie v genómovej DNA..
- Elektroforéza dvojvláknovej DNA v géli (rovnomerne denaturačné, neutrálne). Ide o štiepenie DNA na chemickej a enzymatickej úrovni. Na tých miestach, kde sú základy nesprávne šité, je obvykle definovaná skupina mutácií..
- Štúdia elektroforetickej mobility DNA mutantných molekúl.
- Analýza syntetizovaného proteínu pomocou elektroforézy. Prítomnosť mutácií sa posudzuje zmenou mobility proteínov v in vitro systéme.
Mutácie sú tiež diagnostikované použitím definície polymorfných fragmentov (reštrikčná dĺžka) v genóme. Na tento účel sa používa rovnaká hybridizačná technika Southern blot..
Okrem iných typov DNA polymorfizmu sa rozlišujú mikrosatelity. Sú to krátke sekvencie DNA (tandemové opakovanie mono-, di-, tri- a tetranukleotidov). Slúžia ako markery defektných mutácií alebo markerových lokusov alelických variantov génu v štúdii..
Gén, ktorý je zodpovedný za vývoj Huntingtonovej chorey, ťažkej patológie, bol objavený v roku 1993. S touto chorobou dochádza k poklesu intelektuálneho vývoja, k poruche CNS pohybov u ľudí po 40 rokoch. Choroba je dedičná a prenáša sa autozomálnym dominantným typom, má 100% penetráciu. Gén choroby sa nachádza v 4. chromozóme, v krátkom rameni.
Tento gén zahŕňa nukleotidovú sekvenciu vo forme opakovaných opakovaní CAG nukleotidu. U zdravých ľudí sú takéto opakovania zvyčajne 11-34, pacienti s chorea majú 37-86, ale zvyčajne 45. Z toho vyplýva, že Huntingtonova chorea je dedičnou patológiou s génovou mutáciou v násobnom zvýšení počtu kópií (expanzie).
Julia Viktorová, pôrodník-gynekológ